ELISA para niños

ELISA es el nombre corto de una técnica de laboratorio muy importante que se usa para encontrar ciertas sustancias en una muestra, como la sangre. Su nombre completo en inglés significa "Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas". Imagina que es como un detective que busca pistas muy pequeñas.

Esta técnica detecta si hay un "antígeno" (una sustancia que el cuerpo puede reconocer como extraña, como parte de un virus o bacteria) usando un "anticuerpo" (una proteína que nuestro cuerpo produce para defenderse). Este anticuerpo está unido a una "enzima". Cuando la enzima reacciona con algo, produce un cambio que podemos ver, ¡como un cambio de color!

Los laboratorios usan ELISA para saber si una persona tiene ciertos anticuerpos en su sangre. Esto puede indicar si ha estado expuesta a alguna enfermedad. Aunque es un proceso común, necesita mucho cuidado para que los resultados sean correctos.

ELISA se creó como una opción más segura que otras pruebas que usaban materiales radiactivos. Es muy útil porque permite identificar reacciones específicas y obtener resultados que se pueden medir con precisión.

¿Para qué se usa la prueba ELISA?

La prueba ELISA se usa en el laboratorio para saber si una persona tiene una infección o una enfermedad en la que su propio sistema de defensa ataca a su cuerpo (autoinmune). Sin embargo, es importante saber que esta prueba tiene algunas cosas a considerar:

Posibles resultados inesperados

• Falsos positivos: A veces, un resultado positivo no significa que la persona esté enferma en ese momento. El cuerpo puede seguir produciendo anticuerpos incluso después de haberse recuperado de una enfermedad. Esto podría dar un resultado que parece positivo, pero no lo es.
• Falsos negativos: En otros casos, una persona podría tener pocos anticuerpos, y la prueba no los detecta. Esto puede pasar si el sistema de defensa de la persona no funciona bien, si está en las primeras etapas de una infección, o si la infección es por un tipo diferente de lo esperado.
• También pueden aparecer falsos negativos si el antígeno y el anticuerpo no se unen correctamente.

Para asegurar un diagnóstico correcto, a veces se necesita confirmar un resultado positivo con otra prueba diferente. Por ejemplo, se puede usar una prueba llamada western blot, que busca varios anticuerpos al mismo tiempo. Si se encuentran suficientes anticuerpos diferentes, entonces se confirma el resultado.

Esta técnica es muy útil porque es versátil, confiable y fácil de hacer. Además, se han desarrollado formas de hacerla aún más sensible, lo que significa que puede detectar cantidades muy pequeñas de sustancias.

Aplicaciones importantes de ELISA

ELISA se usa en muchos campos donde se necesita medir sustancias usando anticuerpos. Algunos ejemplos son:

• Diagnóstico de enfermedades: Ayuda a identificar ciertas enfermedades.
• Detección de sustancias en el cuerpo: Puede encontrar marcadores que indican la presencia de ciertas condiciones.
• Identificación de anticuerpos: Sirve para clasificar los tipos de anticuerpos.

Herramientas para la prueba ELISA

Una microplaca de 96 pocillos, usada en las pruebas ELISA.

Al principio, se usaban tubos de cristal, pero ahora se usan unas placas especiales de plástico con muchos pequeños huecos, llamados "pocillos". Estas placas están diseñadas para que las moléculas se peguen bien a su superficie. Los pocillos son transparentes para que se puedan medir los cambios de color con un aparato especial.

Los aparatos que leen estas placas se llaman lectores ELISA. Son como espectrofotómetros que pueden leer muchos pocillos a la vez. A diferencia de otros aparatos que leen muchos tipos de luz, los lectores ELISA solo leen las longitudes de onda de luz que son importantes para ver los cambios de color de la prueba.

Pasos de un ensayo ELISA

Fases de un ensayo ELISA: (1) El anticuerpo primario se une al pocillo. (2) Se añade la muestra con el antígeno. (3) El antígeno se une al anticuerpo primario. (4) Se lava. (5) Se añade el anticuerpo secundario con una enzima. (6) El anticuerpo secundario se une al antígeno. (7) Se lava. (8) Se añade el sustrato. (9) La enzima cambia el sustrato a un color visible. (10) Resultado positivo.

Un ensayo ELISA tiene varios pasos importantes:

1. Unión de la sustancia a buscar (antígeno o anticuerpo) a los pocillos: Se pega el antígeno o el anticuerpo a la superficie de los pocillos de plástico. Es muy importante hacerlo con cuidado. Si se usa mucho antígeno, puede haber falsos positivos. Si se usa muy poco, puede haber falsos negativos.
2. Unión del anticuerpo o antígeno a una enzima: Se une un anticuerpo o antígeno a una enzima (como la peroxidasa). Esta unión debe ocurrir durante un tiempo específico para que se produzca un color que se pueda ver o medir. Si no se deja el tiempo suficiente, no aparecerá color y el resultado será un falso negativo.
3. Activación de la reacción de la enzima: Después de lavar para quitar lo que no se pegó, se añade una sustancia que reacciona con la enzima. Esto crea una reacción que produce color. Luego, se detiene la reacción y se mide la intensidad del color con el lector ELISA.
4. Formación de capas de unión: Dependiendo del tipo de ELISA, se pueden formar una o más capas de unión entre el antígeno y los anticuerpos. Es crucial controlar el tiempo y la temperatura en este paso. Si el tiempo es muy corto o la temperatura muy baja, la unión no se completa, dando falsos negativos. Si la temperatura es muy alta, las proteínas pueden dañarse y no unirse bien, también dando falsos negativos.

Tipos de pruebas ELISA

Un técnico de laboratorio realizando una prueba ELISA.

Existen diferentes tipos de pruebas ELISA, cada una diseñada para un propósito específico:

• ELISA directo: Es el más simple. Se recubren los pocillos con la muestra que podría tener el antígeno. Luego se añaden anticuerpos marcados. Si hay antígeno, los anticuerpos se pegan y se detecta la señal. Se usan controles (muestras sin el antígeno y muestras con el antígeno) para comparar.
• ELISA indirecto: También se recubren los pocillos con la muestra. Pero aquí se usan dos tipos de anticuerpos: uno primario que se une al antígeno, y uno secundario marcado que se une al primario. Esto hace que la señal sea más fuerte y la detección más sensible. Es un método muy popular porque un mismo anticuerpo secundario puede usarse para detectar muchos antígenos diferentes, lo que lo hace más económico. Es el método preferido para detectar anticuerpos en la sangre contra ciertas infecciones, como las causadas por algunos virus.
• ELISA inhibidor o competitivo: Este tipo es más complejo y se usa para detectar antígenos en cantidades muy pequeñas. En este caso, un antígeno de referencia compite con el antígeno de la muestra por unirse a un anticuerpo. Cuanto menos señal se detecte, más antígeno hay en la muestra.
• ELISA "sándwich": En este ensayo, el pocillo se recubre con un primer anticuerpo. Luego se añade la muestra, y si el antígeno está presente, se une a este primer anticuerpo. Después, se añade un segundo anticuerpo marcado que también se une al antígeno. Así, el antígeno queda "atrapado" entre dos anticuerpos, como en un sándwich. Este método es muy específico y sensible.
• ELISpot: Es una variación de ELISA muy sensible que cuenta las células que producen un anticuerpo o una sustancia específica. Las células se colocan en una placa recubierta con un anticuerpo. Las sustancias que las células liberan se unen al anticuerpo, formando un punto de color o luz alrededor de cada célula productora.

Usos en el diagnóstico

La técnica ELISA puede detectar casi cualquier proteína que sea importante para el diagnóstico de enfermedades. Aunque hay otras técnicas más rápidas hoy en día, ELISA sigue siendo muy usada en laboratorios de investigación. Se pueden encontrar kits de ELISA para muchas proteínas humanas.

Algunos ejemplos de su uso en diagnóstico incluyen:

• Detección de marcadores: Ayuda a identificar sustancias que pueden indicar la presencia de ciertas condiciones en etapas tempranas.
• Hepatitis B: Se usa para encontrar partes del virus de la Hepatitis B o los anticuerpos que el cuerpo produce contra él.
• Enfermedades autoinmunes: Detecta anticuerpos que atacan los propios tejidos del cuerpo, como los anticuerpos antinucleares.
• Alergias: Identifica anticuerpos relacionados con reacciones alérgicas a alimentos, polen u otras sustancias.
• Detección de anticuerpos: Se usa para encontrar anticuerpos y antígenos de ciertas infecciones.

Quimioluminiscencia en ELISA

Ensayo ELISA para la detección de anticuerpos.

Algunos tipos de ELISA usan la "quimioluminiscencia", que es la producción de luz durante una reacción química. En lugar de un cambio de color, se genera luz. Esta luz se puede detectar con una película fotográfica o un aparato llamado luminómetro.

La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia es que son mucho más sensibles. Esto significa que pueden detectar cantidades aún más pequeñas de la sustancia que se busca, lo que mejora la precisión de la prueba.

Sustancias usadas en ELISA

En la tabla siguiente se muestran algunas de las enzimas y sustancias que se usan comúnmente en las pruebas ELISA para producir la señal detectable:

Enzima sustrato tampón

• HRP (peroxidasa de rábano) OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0,15 M pH 5; añadir microL de 30 % peróxido de hidrógeno 30 %.
• TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0,1 M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
• ABTS 60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0,1 M pH 6; añadir 35 microL de peróxido de hidrógeno 30 %; parar con fluoruro sódico 1,25 %; leer a 405 nm.
• DAB 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y añadir 20 microL de peróxido de hidrógeno 1 %.
• CNP 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
• AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón acetato 0,1 M pH 4,5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
• ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM NaOH y añadir 10 % por volumen de 0,05 % peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M.
• AP (fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 + 1 mM cloruro de magnesio.
• NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampón Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
• NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
• BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol).
• beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol.
• ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; añadir 100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4 °C.
• PG IS Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia: (A) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampón fosfato pH 7,0; (B) 1 % (peso/vol) almidón en agua destilada caliente; (C) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampón fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); (D) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solución stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT

La prueba ELISPOT es una versión muy sensible de ELISA. Sirve para contar cuántas células en una muestra producen anticuerpos específicos o una sustancia determinada. En esta prueba, las placas se recubren con el antígeno o el anticuerpo que se quiere detectar. Luego, se añaden las células de la muestra. Las sustancias que las células liberan se unen a lo que está en la placa, creando un pequeño círculo de color o luz alrededor de cada célula que produce la sustancia. Después de lavar, se añade un anticuerpo unido a una enzima que ayuda a visualizar estos puntos. Cada punto de color o luz representa una célula que está produciendo la sustancia que se busca.

Véase también

En inglés: ELISA Facts for Kids